DAP-seq实验用到的蛋白表达系统是promega公司的TNTSP6 Wheat Germ Master Mix表达系统（promega  L326A），一种体外真核蛋白表达系统。体外表达用到的载体为promega公司的pFN19K HaloTag® T7 SP6 Flexi® Vector（promegaG184A）。本篇为大家介绍一套超高性价比的载体构建方案：

Part

1

线性化载体

此步骤是通过PCR扩增来线性化载体，PCR后需要切胶回收降低假阳性。

 P-T7sp6-R（线性化反向引物）：cgcgttatcgctctgaaagtac

 P-T7sp6-F（线性化正向引物）：aaacgaattcgggctcggtac

配置反应体系：

反应条件：

电泳切胶回收，片段大小4000左右。

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2

基因克隆

正向引物设计：ttCAGAGCGATAACGCG+ 基因ATG开始上游引物

反向引物设计：cgAGCCCGAATTCGTTT+基因下游引物TAA结束（反向互补）

配置反应体系：

反应条件：

电泳切胶回收片段。

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3

连接转化

重组反应配制反应体系如下： 

反应温度为 50℃ 5min。

将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻。

取 5 - 10 μL 连接产物加入到 100 μL 感受态细胞中，轻弹管壁混匀 ( 请勿振荡混匀 )，冰上静置 30 min。注意：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的 1/10。 

42℃水浴热激 60 sec 后，立即置于冰上冷却2 min。

加入900 μL SOC 或 LB 液体培养基 ( 不添加抗生素 )，37℃摇菌 1 h ( 转速 200 rpm)。

10000 rpm 离心 1min，弃掉900 μL 上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。

37℃培养箱中倒置培养 12 - 16 h。

阳性克隆测序鉴定，提取质粒。

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4

附录

1 测序引物pT7SP6-cx-F：tgcaaggctgtggacatcgg

2  pFN19K模板索取登记电话：13826269811

3 原始载体序列信息

Ggatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggtacgatttaggtgacactatagaataaggagaattcatcatggcagaaatcggtactggctttccattcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgcatgcactacgtcgatgttggtccgcgcgatggcacccctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcctcctacgtgtggcgcaacatcatcccgcatgttgcaccgacccatcgctgcattgctccagacctgatcggtatgggcaaatccgacaaaccagacctgggttatttcttcgacgaccacgtccgcttcatggatgccttcatcgaagccctgggtctggaagaggtcgtcctggtcattcacgactggggctccgctctgggtttccactgggccaagcgcaatccagagcgcgtcaaaggtattgcatttatggagttcatccgccctatcccgacctgggacgaatggccagaatttgcccgcgagaccttccaggccttccgcaccaccgacgtcggccgcaagctgatcatcgatcagaacgtttttatcgagggtacgctgccgatgggtgtcgtccgcccgctgactgaagtcgagatggaccattaccgcgagccgttcctgaatcctgttgaccgcgagccactgtggcgcttcccaaacgagctgccaatcgccggtgagccagcgaacatcgtcgcgctggtcgaagaatacatggactggctgcaccagtcccctgtcccgaagctgctgttctggggcaccccaggcgttctgatcccaccggccgaagccgctcgcctggccaaaagcctgcctaactgcaaggctgtggacatcggcccgggtctgaatctgctgcaagaagacaacccggacctgatcggcagcgagatcgcgcgctggctgtcgacgctcgagatttccggcgagccaaccactgaggatctgtactttcagagcgataacgcg（载体扩增R引物位置） atcgccatggaataagtaaggaatccacatggcacaggttatcaacacgtttgacggggttgcggattatcttcagacatatcataagctacctgataattacattacaaaatcagaagcacaagccctcggctgggtggcatcaaaagggaaccttgcagacgtcgctccggggaaaagcatcggcggagacatcttctcaaacagggaaggcaaactcccgggcaaaagcggacgaacatggcgtgaagcggatattaactatacatcaggcttcagaaattcagaccggattctttactcaagcgactggctgatttacaaaacaacggaccattatcagacctttacaaaaatcagataatgttt（载体扩增F引物位置）aaacgaattcgggctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagcttcaaaagaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgacggtcgtttcgcatgcttgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgcactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgtatgccggatggtgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaaccggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatttcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttatagtccggaaatacaggaacgcacgctggatggcccttcgctgggatggtgaaaccatgaaaaatggcagcttcagtggattaagtgggggtaatgtggcctgtaccctctggttgcataggtattcatacggttaaaatttatcaggcgcgattgcggcagtttttcgggtggtttgttgccatttttacctgtctgctgccgtgatcgcgctgaacgcgttttagcggtgcgtacaattaagggattatggtaaatccacttactgtctgccctcgtagccatcgagataaaccgcagtactccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcttttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcat